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已发表论文
一种新的肺靶向纳米抗体——抗大鼠肺泡表面活性蛋白 A 纳米抗体的制备及其肺靶向性研究
Authors Wang SM, He X, Li N, Yu F, Hu Y, Wang LS, Zhang P, Du YK, Du SS, Yin ZF, Wei YR, Mulet X, Coia G, Weng D, He JH, Wu M, Li HP
Published Date April 2015 Volume 2015:10 Pages 2857—2869
DOI http://dx.doi.org/10.2147/IJN.S77268
Received 10 November 2014, Accepted 23 January 2015, Published 13 April 2015
目的：制备抗大鼠 SP-A 肺靶向性纳米抗体，为肺靶向药物的研发提供理想的靶向配体。
方法：1) 采用人工基因合成、原核表达的方式制备出大鼠 SP-A（rSP-A），以表达的 rSP-A 作为抗原对羊驼进行 5 次免疫；2) 采集免疫羊驼外周血淋巴细胞进行 RNA 提取、cDNA 转化，构建免疫羊驼纳米抗体文库；3) 以 rSP-A 作为筛选原，用固相淘筛法对构建的噬菌体免疫纳米抗体库进行三轮淘筛，获得三级淘筛纳米抗体库；4) 用 phage-ELISA 对三级淘筛纳米抗体库的克隆进行抗原结合能力的初步鉴定，挑选出亲和力高的克隆进行表达、纯化；5) 检测抗大鼠 SP-A 纳米抗体的肺靶向性、安全性。
结果：1) 原核表达的大鼠 SP-A 分子量为 27kDa, 与抗大鼠 SP-A 多克隆抗体存在特异性结合活性。2) 在用大鼠 SP-A 对羊驼进行 5 次有效免疫后，羊驼血中抗体效价达到 1:12000，构建的免疫纳米抗体库的库容为 5.93×105cfu。3) 采用固相淘筛法对免疫噬菌体纳米抗体库进行三轮淘筛，获得了逐轮富集的三级淘筛库。4) 用间接 phage-ELISA 从三级淘筛抗体库中鉴定出 31 个与 rSP-A 存在特异性结合的纳米抗体基因序列，并对出现频率高的 Nb6、Nb17 两个克隆进行了原核可溶性表达。两个纳米抗体蛋白分子量小，仅为 19kDa；用 Western Blot、ELISA 检测出 Nb6、Nb17 两个蛋白均与表达的 rSP-A 存在特异性结合。5) 在用新鲜的大鼠肺、肝、脾、肾、肌肉组织进行的免疫组化及小鼠活体内成像中，两个蛋白显示出明显的肺靶向特异性；在高于常规蛋白给药量 10 倍的大鼠急性毒性实验中, 纳米抗体给药组未检测到对大鼠肝、肾功能损害及对大鼠肝、肾、心、脾等组织器官的病理损害等，表现出良好的安全性。
结论：以在肺部高表达的肺泡表面活性蛋白 A(SP-A) 作为肺靶向分子，首次成功制备出抗大鼠 SP-A 纳米抗体，并证明了抗大鼠 SP-A 纳米抗体的肺靶向性和安全性，为今后探索高效的肺靶向药物提供了理想的配体。
Keywords: nanobodies, rSPA, phage-nanobody library, VHH, lung-targeting drugs
方法：1) 采用人工基因合成、原核表达的方式制备出大鼠 SP-A（rSP-A），以表达的 rSP-A 作为抗原对羊驼进行 5 次免疫；2) 采集免疫羊驼外周血淋巴细胞进行 RNA 提取、cDNA 转化，构建免疫羊驼纳米抗体文库；3) 以 rSP-A 作为筛选原，用固相淘筛法对构建的噬菌体免疫纳米抗体库进行三轮淘筛，获得三级淘筛纳米抗体库；4) 用 phage-ELISA 对三级淘筛纳米抗体库的克隆进行抗原结合能力的初步鉴定，挑选出亲和力高的克隆进行表达、纯化；5) 检测抗大鼠 SP-A 纳米抗体的肺靶向性、安全性。
结果：1) 原核表达的大鼠 SP-A 分子量为 27kDa, 与抗大鼠 SP-A 多克隆抗体存在特异性结合活性。2) 在用大鼠 SP-A 对羊驼进行 5 次有效免疫后，羊驼血中抗体效价达到 1:12000，构建的免疫纳米抗体库的库容为 5.93×105cfu。3) 采用固相淘筛法对免疫噬菌体纳米抗体库进行三轮淘筛，获得了逐轮富集的三级淘筛库。4) 用间接 phage-ELISA 从三级淘筛抗体库中鉴定出 31 个与 rSP-A 存在特异性结合的纳米抗体基因序列，并对出现频率高的 Nb6、Nb17 两个克隆进行了原核可溶性表达。两个纳米抗体蛋白分子量小，仅为 19kDa；用 Western Blot、ELISA 检测出 Nb6、Nb17 两个蛋白均与表达的 rSP-A 存在特异性结合。5) 在用新鲜的大鼠肺、肝、脾、肾、肌肉组织进行的免疫组化及小鼠活体内成像中，两个蛋白显示出明显的肺靶向特异性；在高于常规蛋白给药量 10 倍的大鼠急性毒性实验中, 纳米抗体给药组未检测到对大鼠肝、肾功能损害及对大鼠肝、肾、心、脾等组织器官的病理损害等，表现出良好的安全性。
结论：以在肺部高表达的肺泡表面活性蛋白 A(SP-A) 作为肺靶向分子，首次成功制备出抗大鼠 SP-A 纳米抗体，并证明了抗大鼠 SP-A 纳米抗体的肺靶向性和安全性，为今后探索高效的肺靶向药物提供了理想的配体。
Keywords: nanobodies, rSPA, phage-nanobody library, VHH, lung-targeting drugs
